טכניקות עבור דנ"א רצף

תחום הביוטכנולוגיה הוא שינוי מתמיד. הצמיחה המהירה והפיתוח של מחקר חדשני תלויים בחדשנות וביצירתיות של המדענים וביכולתם לראות את הפוטנציאל בטכניקה מולקולרית בסיסית וליישם אותו בתהליכים חדשים. הופעת PCR פתח דלתות רבות במחקר גנטי, כולל אמצעי של ניתוח DNA וזיהוי של גנים שונים המבוססים על רצפי DNA שלהם.

-> ->

רצף ה- DNA תלוי גם ביכולתנו להשתמש בג'ל אלקטרופורזה כדי להפריד בין גדילי דנ"א הנבדלים בגודל של זוג אחד בלבד.

דנ"א רצף

בסוף 1970, שתי שיטות DNA רצף עבור מולקולות DNA יותר הומצאו. אלה היו שיטת Sanger (או dideoxy) ושיטת Maxam-Gilbert (כימיקל כימי). שיטת Maxam-Gilbert מבוססת על מחשוף של נוקליאוטידים ספציפיים על ידי חומרים כימיים, והוא משמש בצורה הטובה ביותר לרצף אוליגונוקליוטידים (פולימרים נוקליאוטידים קצרים, בדרך כלל קטנים מ -50 זוגות בסיס). השיטה סנגר הוא נפוץ יותר כי זה הוכח מבחינה טכנית קל יותר ליישם, ועם כניסתו של PCR ואוטומציה של הטכניקה, מוחל בקלות על גדילים ארוכים של DNA כולל כמה גנים. טכניקה זו מבוססת על סיום שרשרת ידי dideoxynototides במהלך התגובות PCR התארכות.

בשיטת סנגר, גדיל ה- DNA להיות מנותח משמש כתבנית ו DNA פולימראז משמש, בתגובת ה- PCR, כדי ליצור גדילים חינם באמצעות primers.

ארבע תערובות שונות של תגובת ה- PCR מוכנות, שכל אחת מהן מכילה אחוז מסוים של אנלוגים dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) לאחת מארבע נוקליאוטידים (ATP, CTP, GTP או TTP). סינתזה של גדיל ה- DNA החדש נמשך עד שאחד האנלוגים האלה משולב, ובאותו זמן גדיל הוא חתך בטרם עת.

כל תגובה PCR בסופו של דבר המכיל תערובת של אורכים שונים של גדילי דנ"א, כל הסוף עם נוקלאוטיד זה היה dideoxy שכותרתו עבור התגובה. ג'ל אלקטרופורזה משמש אז כדי להפריד את הגדילים של ארבע התגובות, בארבעת נתיבים נפרדים, ולקבוע את הרצף של התבנית המקורית על סמך מה אורך של גדילים בסופו של דבר עם מה נוקליאוטידים.

בתגובת סנגר האוטומטית, פריימרים משמשים כי הם מסומנים עם ארבעה תוויות ניאון צבעוניים שונים. תגובות PCR, בנוכחות של נוקליאוטידים dideoxy שונים, מתבצע כמתואר לעיל. עם זאת, הבא, ארבע תערובות התגובה משולבים ואז להחיל על נתיב אחד של ג'ל. הצבע של כל קטע מזוהה באמצעות קרן לייזר והמידע נאסף על ידי מחשב אשר מייצר chromatograms מראה פסגות עבור כל צבע, שממנו רצף DNA תבנית ניתן לקבוע.

בדרך כלל, שיטת הסידור האוטומטי היא רק מדויק עבור רצפים עד למקסימום של כ-700-800 זוגות באורך. עם זאת, ניתן להשיג רצפים מלאים של גנים גדולים יותר, למעשה, גנומים שלמים, תוך שימוש בשיטות צעד חכם כגון הליכה פריימר ורצף רובה.

ב

הליכה פריימר

, חלק מעובד של גן גדול יותר הוא רצף בשיטת סנגר. פריימרים חדשים נוצרים מתוך קטע אמין של רצף ומשמש להמשיך רצף את החלק של הגן כי היה מחוץ לטווח של התגובות המקוריות. ציד רובה כרוך באופן אקראי חיתוך קטע ה- DNA של עניין לתוך שברי בגודל מתאים יותר (לניהול), רצף כל קטע, וסידור החלקים על בסיס רצף חופפים. טכניקה זו נעשתה קלה יותר על ידי יישום של תוכנת מחשב לסידור חתיכות חופפות.